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Une étude à l'échelle du protéome révèle comment les surfaces en plastique et l'agitation favorisent l'agrégation des protéines

Jul 21, 2023Jul 21, 2023

Rapports scientifiques volume 13, Numéro d'article : 1227 (2023) Citer cet article

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L'agrégation des protéines dans les produits biothérapeutiques peut réduire leur activité et leur efficacité. Il peut également favoriser des réactions immunitaires responsables d’effets indésirables graves. L’impact des matières plastiques sur la déstabilisation des protéines n’est pas totalement compris. Nous proposons ici de déconvolutionner les effets de surface du matériau, d’interface air/liquide et d’agitation pour décrypter leur rôle respectif dans la déstabilisation et l’agrégation des protéines. Nous avons analysé l'effet des surfaces en polypropylène, TEFLON, verre et LOBIND sur la stabilité des protéines purifiées (albumine sérique bovine, hémoglobine et α-synucléine) et sur un extrait cellulaire composé de 6000 protéines solubles lors de l'agitation (P = 0,1–1,2 W/ kg). L'analyse protéomique a révélé que les chaperonines, les protéines intrinsèquement désordonnées et les ribosomes étaient plus sensibles aux effets combinés des surfaces matérielles et de l'agitation, tandis que les petits oligomères métaboliques pouvaient être protégés dans les mêmes conditions. Les observations de perte de protéines couplées à la microscopie Raman, à la diffusion dynamique de la lumière et à la protéomique nous ont permis de proposer un modèle mécaniste de déstabilisation des protéines par les plastiques. Nos résultats suggèrent que la perte de protéines n'est pas principalement due à la nucléation de petits agrégats en solution, mais à la déstabilisation des protéines exposées aux surfaces des matériaux et à leur agrégation ultérieure à l'interface air/liquide cisaillé, un effet qui ne peut être évité en utilisant LOBIND. tubes. Des lignes directrices peuvent être établies sur la manière de minimiser ces effets indésirables. Supprimez l’un des composants de ce stress combiné – matière, air (même partiellement), ou agitation – et les protéines seront préservées.

Le nombre de thérapies à base de protéines augmente rapidement. Cependant, les protéines sont exposées à des contraintes lors de leur fabrication, affectant leur stabilité. L'agrégation de protéines dans les produits biothérapeutiques peut réduire leur activité et leur efficacité, mais elle peut également favoriser des réactions immunitaires responsables d'effets indésirables graves tels que des réponses allergiques et l'anaphylaxie1.

Diverses stratégies ont été développées pour éviter l'agrégation des protéines lors du traitement des produits biothérapeutiques, soit en contrôlant soigneusement l'environnement et le processus locaux, soit en supprimant les agrégats avant l'échantillonnage. Les facteurs physiques et chimiques qui déterminent la stabilité des protéines ou déclenchent leur agrégation font depuis longtemps l’objet de recherches dans les domaines pharmaceutique et biochimique. L’agitation, la température, le pH et la force ionique sont connus pour induire l’agrégation des protéines1,2,3.

L’effet des matériaux sur la stabilité des protéines dans le traitement des produits biothérapeutiques a été comparativement moins étudié. En effet, l’image actuelle est depuis longtemps celle d’une perte minimale de protéines par adsorption sur les surfaces, où les interactions protéine/matériau n’entraîneraient qu’une passivation de surface sans affecter les protéines libres restantes en solution. Dès les années 1970, Leo Vroman4,5 a démontré que l’adsorption des protéines n’était pas un processus statique, mais plutôt dynamique où des échanges se produisaient à l’interface liquide-solide entre protéines libres et adsorbées en fonction de la concentration protéique et de l’affinité pour la surface. Ce modèle peut désormais être complété par la perte partielle de stabilité des protéines suite à de faibles interactions avec la surface et leur libération ultérieure dans la solution6, première étape vers un effet d'interfaces à distance.

Des études récentes ont démontré que l’effet déstabilisant des interfaces solide/liquide sur la stabilité des protéines était plus profond qu’on ne le pensait initialement et pouvait être renforcé par l’agitation. Les effets synergiques du flux et des surfaces sur l’agrégation des anticorps ont déjà été décrits7,8. D'autres études ont souligné le rôle des bulles d'air9,10. Ces observations suggèrent que l’interface solide/liquide, l’interface air/liquide et l’agitation sont des acteurs clés lorsqu’on considère l’effet d’un nouveau processus ou d’un nouveau matériau lors de la production de produits biothérapeutiques. Cependant, la description mécanistique qui pourrait expliquer les processus impliqués et l'interaction entre les différentes interfaces et l'agitation sur la stabilité des protéines fait défaut. De plus, la plupart des études expérimentales ont été menées avec des protéines purifiées uniques, ce qui ne peut pas expliquer le rôle des interactions protéine-protéine lorsque différentes protéines sont impliquées, l'association et la dissociation possibles de complexes protéiques aux interfaces, ainsi que les variations de sensibilité des protéines à ces stress.

 1 µm) were identified in the protein solutions after wheel rotating agitation in PP tubes. Optical microscopy using reflected light and contour reconstruction with Fiji software were applied to better visualize their shape and structure (Fig. 7A). The size of the objects ranged from a few to tens of micrometers, though no inner structure could be seen./p> 1) (see supporting file proteomic-SI2 for the protein list). Among these proteins, 58 proteins were highly depleted and 31 proteins were highly enriched, taking a threshold of minimum 15% concentration variation after mixing. No significant differences were observed as a function of the material, with most depleted and most enriched proteins observed for all the different types of surfaces. Highly enriched and highly depleted proteins were classified as complexes, oligomers, chaperonins, partially unfolded proteins or IDPs, and others (Fig. 11)./p> 1) or not (BFsim ≤ 1). The depletion of a given protein was assessed using a majority voting decision rule on 100 simulations. Proteins with simulated low abundances (quantities < 5 fmol) were removed in accordance to the LOD and LOQ determined experimentally. The results of the simulation for PP surface are shown in Fig. 12. The line depicts the simulated number of depleted proteins to achieved the target mass loss. For PP surface, to achieve a 15% mass loss, 125 proteins needed to be non selectively depleted, whereas only 58 are in the experiment. Our analysis shows also (supporting information part SF) that about 80% of the depleted proteins identified experimentally by proteomic show a stronger depletion than proteins from the simulated dataset. These two results demonstrate that protein depletions above 15% in the system are not due to a random process but rather to a selective depletion from the extract./p>